膜聯(lián)蛋白V可以與包括APC的熒光染料綴合。這種形式保留了其對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力，因此可用作流式細(xì)胞儀分析正在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的敏感探針。由于PS的外化發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段，APC膜聯(lián)蛋白V染色可以在比基于核變化（例如DNA片段化）的測定更早的階段鑒定細(xì)胞凋亡。 APC膜聯(lián)蛋白V染色先于膜完整性的喪失，這伴隨著由細(xì)胞凋亡或壞死過程引起的最新細(xì)胞死亡階段。因此，APC膜聯(lián)蛋白V染色通常與重要染料如碘化丙啶（PI）或7-氨基放線菌素（7-AAD）聯(lián)合使用，以使研究人員能夠識(shí)別早期凋亡細(xì)胞（7-AAD陰性，APC）膜聯(lián)蛋白V陽性）。具有完整膜的活細(xì)胞排除7-AAD，而死亡和受損細(xì)胞的膜對(duì)7-AAD是可滲透的。例如，被認(rèn)為存活的細(xì)胞是APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性，而早期細(xì)胞凋亡的細(xì)胞是APC膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性，而晚期凋亡或已經(jīng)死亡的細(xì)胞都是APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性。該測定不區(qū)分經(jīng)歷凋亡性死亡的細(xì)胞與由于壞死途徑而死亡的細(xì)胞，因?yàn)樵谌我磺闆r下，死細(xì)胞將用APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。然而，當(dāng)隨時(shí)間測量細(xì)胞凋亡時(shí)，通常可以從APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性（存活或無可測量的細(xì)胞凋亡）追蹤細(xì)胞，APC膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性（早期細(xì)胞凋亡，膜完整性存在） ）最后到APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性（末期凋亡和死亡）。細(xì)胞通過這三個(gè)階段的運(yùn)動(dòng)表明細(xì)胞凋亡。相比之下，單個(gè)觀察結(jié)果表明細(xì)胞本身是APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性，它們揭示了關(guān)于細(xì)胞經(jīng)歷其死亡的過程的較少信息。

儲(chǔ)備溶液配制

1. APC-Annexin V原液（100X）：
將含有0.2％BSA的200μLPBS加入到APC-膜聯(lián)蛋白V綴合物（組分A）的小瓶中并充分混合以制備100X APC-膜聯(lián)蛋白V儲(chǔ)備溶液。 注意：將重構(gòu)的100X APC-Annexin V儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在4 ℃。 除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。

操作步驟

1.用測試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。注意：膜粘附細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。

2.離心細(xì)胞，得到1-5×10⁵個(gè)細(xì)胞/管。

3.將細(xì)胞重懸于200μL測定緩沖液（組分B）中。

4.向細(xì)胞中加入2μL100XAPC-膜聯(lián)蛋白V原液。

5.可選：將2μL100X碘化丙啶（組分C）加入細(xì)胞中，用于壞死細(xì)胞。

6.在室溫下孵育20至60分鐘，避光。

7.可選：在使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞之前，添加200至300μL的測定緩沖液（組分B）以增加體積。

8.使用具有FL4通道的流式細(xì)胞儀（Ex / Em = 635 / 660nm）監(jiān)測APC-膜聯(lián)蛋白V的熒光強(qiáng)度。當(dāng)?shù)饣ぜ尤爰?xì)胞時(shí)，使用FL2通道測量細(xì)胞活力。